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OM-1-ph标准型含酚红金牌基质胶
产品货号:OM-1-ph

研究人员能够利用赛拉达OrganoGel基质胶模拟2D和3D细胞培养应用所需的体内环境。
赛拉达OrganoGel是从小鼠肿瘤组织提取的基底膜成分,所形成的基质胶。该基质胶主要成分为laminin , collagenIV , heparan sulfate proteoglycans(Kleinman et al. 1986)。同时,该基质胶也包含多种生长因子,例如表皮生长因子 EFG,血小板衍生生长因子 PDGF,神经生长因子NGF,碱性成纤维细胞生长因子FGF-2,乙型转化生长因子 TGF-beta和胰岛素样生长因子ILGF(Vukicevic et al. 1992)。


产品背景:

基底膜是动物体内上皮细胞基底面的一层基质膜。赛拉达OrganoGel是从小鼠肿瘤组织提取的基底膜成分,所形成的基质胶。该基质胶主要成分为 laminin , collagen IV , heparan sulfateproteoglycans(Kleinman et al. 1986)。同时,该基质胶也包含多种生长因子,例如表皮生长因子 EFG,血小板衍生生长因子 PDGF,神经生长因子 NGF,碱性成纤维细胞生长因子FGF-2,乙型转化生长因子 TGF-beta 和胰岛素样生长因子 ILGF(Vukicevic et al. 1992)。 

来源:

小鼠肿瘤基底膜成分 

存储条件:

建议用户第一次融化后按照单次用量进行分装,保存-80℃ 冰箱,有效期2年。 

产品特性:

本品在4°C条件下为液态,但在加热到37°C时呈凝胶状态。基质胶凝固后,重新放回4°C过夜,基质胶可再次液化。 

注意事项:

该基质胶在温度高于10°C时就会开始凝固成胶,所以尽量在冰上操作基质胶。类器官传代时,如果为了避免酶对类器官造成影响,可直接用4°C 预冷的基础培养基对基质胶进行缓慢吹打,即可将类器官从基质胶中释放出来。 

产品应用:

本品适用于类器官生长、分化、代谢和毒理学研究,体内和体外血管生成实验。 

注意事项:

该基质胶在温度高于10°C时就会开始凝固成胶,所以尽量在冰上操作。类器官传代时,如果为了避免酶对类器官造成影响,可直接用4°C预冷的基础培养基对基质胶进行缓慢吹打即可将类器官从基质胶中释放出来。

  • 操作方法
  • 实际应用案例
  • 常见问题解答

一 、肿瘤类器官药敏实验(操作所需时间为2小时

1.将扩增好足够量的肿瘤类器官(实验组)以及正常类器官(对照组)用4°C预冷的基础培养基进行重悬,缓慢机械吹打,促进胶液化溶解,并保持类器官结构完整(可用于悬浮培养于有5%基质胶溶液的基质胶表面)(Guillen et al.2022)。或者通过 TryplE 酶消化获得单细胞悬液。

2.离心收集类器官细胞,并进行细胞计数。
3.加入OrganoGel基质胶原液,与细胞进行混匀。
4.将细胞与胶的混合物,通过排枪加入37°C预热过的96孔板,或者384孔板,立即将孔板放入培养箱。
5.大约10min后,OrganoGel基质胶将凝固,加入相应体积的类器官培养液进行培养。
6.类器官形成后(如果是机械吹打,类器官将在传代 24h后就会形成;如果是酶消化,类器官会在3-5天后形成),每个孔分别加入含有PI染料以及不同种类、不同浓度的待筛选的抗肿瘤药物。
7.用高内涵显微镜上进行活细胞成像,测定肿瘤类器官对各种药物的敏感性。


二 、血管生成实验(以永生化HUVEC细胞系为例,操作所需时间为1小时)

1.将完全培养基换成饥饿细胞用培养基:加入含0.2%FBS,2mML-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,100U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。
2.将OrganoGel基质胶均匀铺满96孔板底。 注意:枪头需提前预冷半小时。尽量在冰上操作,避
免基质胶过早固化,避免气泡产生。
3.将 96 孔板在细胞培养箱孵育 30min,固化基质胶。
4.消化 HUVEC细胞,并计数。
5.将 200 µ L 的 HUVEC 细胞悬液(含 5X10^4个细胞)加于含基质胶的96孔板中。将96孔板放于培养箱。
6.血管样网络结构将于3至12小时间形成。
7.在血管网络形成最佳时间,小心去除培养基,并用加入含活细胞染料1/1000 Calcein AM(绿色)的培养基进行染色,并用显微镜进行拍照记录。


三 、神经轴突3D生长实验(以大鼠胚胎神经干细胞为例,操作所需时间为2小时)
1.取孕期 12-15 天的大鼠胚胎,用眼科剪和眼科镊分离出大脑皮层于4°C预冷的DMEM培养基中。
2.用吸管轻缓吹打,然后用70µm滤网过来,获得单细胞悬液,并进行细胞计数。
3.离心(300g,3min),弃上清。将细胞与OrganoGel基质胶进行混合,然后将基质胶混合物滴加在24孔板中,每孔50µl。
4.将24孔板放于培养箱,大约10min后,OrganoGel基质胶将凝固。加入1mL神经元分化培养基:Neurobasal medium,2% B27, 2mML-glutamine,5%FBS,20ng/mLEGF 和20ng/mL bFGF,100U/mL penicillin和100µg/mLstreptomycin。第二天开始,就能观察到有明显的神经轴突生长。
5.在第7天可观察到大量的神经突(Neurite)长出。


人原发肠癌类器官在友商公司的基质胶和 OrganoGel 基质胶中的生长情况

肝癌类器官在 A 公司的基质胶和 OrganoGel 基质胶中的生长情况。肝癌类器官由细胞核染料 DAPI(蓝色),肝脏细胞生物标志物 HNF4a 和肝癌标志物 GPC3 的抗体染色成像

人脐静脉内皮细胞 HUVEC 在 A 公司的基质胶和 OrganoGel 基质胶上均可形成血管网络。HUVEC 细胞由活细胞染料 Calcein AM 染色(绿色)成像
  • 1.OrganoGel 高浓度基底膜基质用于哪些实验?
    OrganoGel 高浓度基底膜基质可适用于体内应用研究,如高浓度蛋白可促进肿瘤生长。高蛋白浓度同时可使 OrganoGel 基底膜基质注射入小鼠皮下后保持完整,有利于注射的肿瘤细胞和/或血管生成因子的原位保持,便于用于原位分析和/或以后的切除。
  • 2.如何将 OrganoGel 基底膜基质用于 3D 培养?怎样制作 3D 胶?需要将细胞嵌入到 OrganoGel 基底膜基质中吗?
    OrganoGel 高浓度基底膜基质可适用于体内应用研究,如制备厚层包被用于 3D 细胞培养。细胞可以嵌在 OrganoGel 基底膜基质中或者接种在 OrganoGel 基底膜基质表面(覆盖法)。
  • 3.使用 OrganoGel 基底膜基质时,需要将移液器吸头和离心管预冷吗?
    是的。因为 OrganoGel 基底膜基质在高于 10℃的条件下即会开始成胶,我们推荐操作基底膜基质时使用预冷的移液管、吸头和离心管。
  • 4.OrganoGel 基底膜基质会快速聚合吗?
    OrganoGel 基底膜基质在 10℃至 35℃时会快速聚合成胶。
  • 5.什么情况下,需要使用无酚红 OrganoGel 基底膜基质?
    对于涉及颜色检测的实验,推荐使用无酚红 OrganoGel 基底膜基质,如使用荧光染料或Drabkins 法计数内皮细胞成管实验。对于子宫内膜细胞培养,也需使用无酚红 OrganoGel 基底膜基质。此外,酚红和非甾体雌激素结构类似,有类雌激素效应。在实验动物体内可能具有干扰内分泌和荷尔蒙代谢的能力。
  • 6.如何从 OrganoGel 基底膜基质中收获细胞?
    推荐使用中性蛋白酶或细胞回收解决方案来收获培养在 OrganoGel 基底膜基质中的细胞。中性蛋白酶相比胰酶、胶原酶或其他蛋白水解酶能够更温和有效地获得单细胞悬液,不会损伤细胞或细胞表面蛋白。对于需要继续接种培养或进行检测的细胞,使用中性蛋白酶不会产生损伤。此外中性蛋白酶也可以用于组织分离。
    对于代谢研究和 RNA 抽提,建议在 4℃使用细胞回收解决方案进行非酶反应的细胞收集。因为 OrganoGel 基底膜基质中含有痕量的 RNA,进行 RNA 分析时,应设一个 OrganoGel 基底膜基质(不接种细胞)的对照组。其它从 OrganoGel 基底膜基质中收获细胞的方法:降低温度至 4℃-6℃使 OrganoGel 基底膜基质解聚,需要一定的时间并且仅适合一部分应用。
  • 7.OrganoGel 基底膜基质包被过的培养皿可以储存多长时间呢?
    包被过的培养皿最好当天使用,具体情况取决于实验目的。需要保存的情况下,可在 37°C培养箱中最多存放 7 天。保存时 OrganoGel 基底膜基质表面需要使用无血清培养基均匀覆盖,保持湿润。
  • 8.哪些情况下应该选用薄胶?什么时候用厚胶呢?3D 培养有哪些应用?
    薄胶主要用于辅助细胞贴壁,有利于细胞增殖。如原代细胞培养,需要一层薄薄的蛋白层辅助,就可以选用薄胶;厚胶主要用于 3D 细胞培养,如大鼠主动脉组织分化为毛细血管样结构(RingAssay),以及进行细胞侵袭实验等;3D 细胞培养实验,主要是用于研究细胞与细胞间的相互作用以及复杂结构,如生物组织等。
  • 9.进行内皮管形成实验,应该选用多大浓度的 OrganoGel 基底膜基质呢?
    进行该实验,OrganoGel 基底膜基质最低浓度应不低于 10mg/mL。
  • 10.OrganoGel 基底膜基质的最低成胶浓度是多少?
    不同的实验目的需要不同的 OrganoGel 基底膜基质浓度,用户应该根据具体的实验需求确 定。OrganoGel 基底膜基质最低成胶浓度为 7mg/mL。稀释时不要简单进行体积倍比稀释, 不同批次间的 OrganoGel 基底膜基质浓度有差异,应该根据最终工作浓度(mg/mL)算出需要 加入的稀释液体(如 PBS 或无血清培养基)的量。用于体内研究的 OrganoGel 基底膜基质, 为了避免成胶不完全,最终工作浓度不应低于 10mg/mL。
  • 11.OrganoGel 基底膜基质胶块在体内可以维持多长时间?
    基质胶胶块可以在体内维持至少一周的时间。
  • 12.怎样稀释 OrganoGel 基底膜基质?
    使用冰上预冷的无血清培养基或者 PH7.4 的 PBS。
  • 13.应该如何对 OrganoGel 基底膜基质移液操作?
    推荐使用预冷的移液器或者注射器操作,移液管、枪头同样需要预冷。吸液时不要触及瓶子 底部;分液时切忌过快、用力过猛。如果使用移液管(Pipets),需要分液 5mL 时,应该吸 取 6mL,分液到移液管内仍有 1mL 时即停止;如果使用自动移液器(Pipetman),按压到第 二档位吸液,然后按压到第一档位进行分液。
  • 14.为什么我的 OrganoGel 基底膜基质很粘稠?
    基质胶的蛋白浓度越高,胶体越粘稠。如果浓度高于 13.0mg/mL,基质胶会显得非常厚重。 OrganoGel 基底膜基质基质胶产品在未稀释前都会比较粘稠。粘稠的高浓度 OrganoGel 基底 膜基质不稀释也可以直接使用,如用于培养肿瘤细胞和/或血管生成因子,注射于小鼠体内 后,细胞可以保持原位,便于原位分析和/或以后的切除;或者稀释后,按照标准浓度的 OrganoGel 基底膜基质产品使用方法使用,具体稀释浓度根据实验需求确定。 除因为产品本身浓度高而粘稠外,基质胶的状态还与运输过程中温度的变化和储藏条件有 关。整个运输过程中必须使用干冰冷藏。如果储藏 OrganoGel 基底膜基质的冰箱带有自动除 霜功能,冰箱除霜过程中升温,可能使基质胶成胶。所以,切忌将 OrganoGel 基底膜基质储 藏于此类冰箱中。为保证 OrganoGel 基底膜基质的使用效果,冻融次数应该尽可能减少。拿 到新的 OrganoGel 基底膜基质后,请按照单次用量进行分装。每次融化操作,OrganoGel 基 底膜基质都应该放置于冰上。
  • 15.为什么 OrganoGel 基底膜基质在 37°C 成胶,而在 4°C 时却呈液体状态?
    OrganoGel 基底膜基质是一种从小鼠肿瘤中提取的重组基底膜,新鲜提取的原料中主要包括 以下成分:层粘连蛋白,IV 型胶原,巢蛋白,基底膜聚糖、表皮生长因子、类胰岛素生长因 子及其他生长因子。这些蛋白构成了 OrganoGel 基底膜基质的基本结构。在 22℃-37℃温度 条件下,大分子间的共价键可以结合,促使 OrganoGel 基底膜基质形成凝胶。而在低温条件 (如 4℃)下,由于没有足够的能量促使共价键结合,所以 OrganoGel 基底膜基质呈现液体 状态。
  • 16.OrganoGel 基底膜基质可以反复冻融吗?
    建议用户第一次融化后按照单次用量进行分装,保存。
  • 17.为什么细胞没有贴壁?OrganoGel 基底膜基质也脱落了?
    首先需要检查细胞的接种浓度是否过高,OrganoGel 基底膜基质的用量应等同于细胞培养体 系中培养基的用量。如果 OrganoGel 基底膜基质被稀释到过低的浓度,形成的胶体容易从组 织培养器皿表面分离。
  • 18.未稀释的 OrganoGel 基底膜基质中出现的沉淀应该怎么样处理?
    4℃下低速离心,去除沉淀物。
  • 19.未使用完的 OrganoGel 基底膜基质应该怎样保存的?
    与细胞培养基或缓冲液混合过但未使用完的 OrganoGel 基底膜基质,不建议保留再用。
  • 20.OrganoGel 基底膜基质可以储存在-70℃吗?
    是的。OrganoGel 基底膜基质可以储存在-70℃。建议客户将整瓶的 OrganoGel 基底膜基质进 行分装,储存于聚丙烯或其他可以耐受超低温条件材质的小管中,方便保存和使用。
  • 21.OrganoGel 基底膜基质会有自发荧光吗?
    OrganoGel 基底膜基质是一种蛋白混合物了,所以 OrganoGel 基底膜基质可能引发荧光的组 分为蛋白质成分。如果需要使用荧光检测细胞生长状态,建议使用者建立对照实验,在所需 要的波长条件下进行对比,以便排除背景荧光。
  • 22.使用 OrganoGel 基底膜基质培养的细胞,如果需要进行切片或者免疫组织化学及免疫荧 光检验,该怎样固定呢?如何避免解聚?
    可以使用 2%浓度的多聚甲醛进行固定。为避免固定后出现解聚的情况,可以加入 1%浓度 的戊二醛。戊二醛作为固定剂,常用于电镜观察。如果用户需要进行免疫荧光检验,加入戊 二醛后,会出现明显的背景荧光。为了解决这一问题,我们建议用户在固定之后,使用 NaBH4 进行淬灭。NaBH4 极易产生气泡,进行该步骤时,必须在水平操作台上小心操作,避免晃 动,尽量减少气泡的形成。另外,用户也可以尝试使用较低浓度的戊二醛进行固定,如 0.1% 到 0.5%,浓度越低,背景荧光信号越少。
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